Антитела, белки и наборы ELISA CTLA-4/CD152 | Терапевтические мишени

CTLA-4 (CD152 / Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4) — ко-ингибиторный рецептор иммунного контрольного пункта, подавляющий активацию Т-клеток путём конкуренции с CD28 за связывание с лигандами B7 (CD80/CD86). Будучи первой мишенью иммунного контрольного пункта, на которую было направлено одобренное FDA антитело — Ипилимумаб (Yervoy) — CTLA-4 занимает центральное место в иммуноонкологии, комбинированной терапии контрольных точек и исследованиях трансплантационной толерантности. abinScience предлагает рекомбинантные белки CTLA-4, антитела к CTLA-4, стандарты биоаналогов и наборы ELISA.

Биология и механизм действия CTLA-4

CTLA-4 — это трансмембранный гликопротеин I типа массой ~25 кДа, экспрессируемый на активированных Т-клетках и конститутивно на регуляторных Т-клетках (Treg). Он разделяет лиганды B7 — CD80 (B7-1) и CD86 (B7-2) — с ко-стимуляторным рецептором CD28, но связывается с ~10-20-кратно более высокой аффинностью, эффективно конкурентно ингибируя CD28 и блокируя активацию Т-клеток.

CTLA-4 подавляет ответы Т-клеток посредством двух механизмов: клеточно-внутренняя передача сигнала — рекрутирование фосфатаз (SHP-2, PP2A) для ослабления сигналов ниже TCR/CD28; и клеточно-внешняя функция — трансэндоцитоз CD80/CD86 с антигенпрезентирующих клеток, снижающий доступную ко-стимуляцию для других Т-клеток. Этот двойной механизм делает блокаду CTLA-4 особенно эффективной для усиления праймирования противоопухолевых иммунных ответов в лимфатических узлах.

Основные области исследований

Разработка ингибиторов контрольных точек Рекомбинантные белки CTLA-4 для скрининга и характеризации терапевтических антител к CTLA-4. Стандарт биоаналога Ипилимумаба для анализа связывания и сравнения биоактивности.

Анализы блокирования CTLA-4/B7 Химерные белки CTLA-4-Fc и белки CD80/CD86 для конкурентного связывания, репортерных генных анализов и функциональных блокирующих исследований с измерением высвобождения IL-2 или пролиферации Т-клеток.

Исследования комбинированной терапии Реагенты для двойной блокады контрольных точек CTLA-4 + PD-1/PD-L1, включая подобранные белки и антитела для обеих мишеней на одной платформе.

Анализы PK/ADA и иммуногенности Пары антител к CTLA-4 и калибраторные белки CTLA-4 для разработки ELISA фармакокинетики и антител к лекарственному средству (ADA) в программах биоаналогов Ипилимумаба.

Руководство по выбору продуктов CTLA-4

Применение	Рекомендуемый продукт	Формат
Кинетика связывания SPR/BLI	Рекомбинантный белок CTLA-4	Avi-tagged или биотинилированный
Блокирующий анализ CTLA-4/B7	CTLA-4-Fc + белки CD80/CD86	Fc-химера
Сэндвич-ELISA / количественное определение	Набор ELISA CTLA-4 или пара антител	Подобранная пара захват/детекция
Проточная цитометрия / профилирование Treg	Антитело к CTLA-4	Конъюгаты PE, APC или BV421
Детекция WB / IP	Моноклональное антитело к CTLA-4	Неконъюгированное
Аналитическая сопоставимость / референс	Биоаналог Ипилимумаба	Research-grade RUO

Часто задаваемые вопросы о CTLA-4

В чём разница между блокадой CTLA-4 и блокадой PD-1?

Блокада CTLA-4 действует преимущественно на стадии праймирования Т-клеток в лимфатических узлах, предотвращая конкурентное ингибирование CD28 со стороны CTLA-4 при связывании с лигандами B7, что усиливает активацию Т-клеток. Блокада PD-1 действует в микроокружении опухоли, предотвращая истощение эффекторных Т-клеток, опосредованное PD-L1/PD-L2. Оба механизма комплементарны, что объясняет синергический клинический эффект комбинированной терапии CTLA-4 + PD-1 (Ипилимумаб + Ниволумаб) при множественных типах опухолей.

Какой формат белка CTLA-4 использовать для блокирующих анализов?

Для блокирующих анализов рекомендуется химера CTLA-4-Fc, поскольку Fc-домен обеспечивает бивалентное связывание, имитирующее авидность нативного гомодимера CTLA-4. Используйте в сочетании с рекомбинантными белками CD80 или CD86 для постановки конкурентных анализов связывания или репортерных генных анализов. Для кинетики SPR, где необходима моновалентная аффинность, используйте His-tagged ECD CTLA-4.

Предлагаете ли вы биоаналог Ипилимумаба в качестве референса?

Да. Мы предлагаем исследовательский биоаналог Ипилимумаба (анти-CTLA-4 человека, подкласс IgG1), произведённый в клетках CHO. Подходит в качестве положительного контроля в анализах связывания CTLA-4, стандарта для разработки биоаналитических методов и исследований аналитической сопоставимости. Только для RUO, не предназначен для терапевтического использования.

Можно ли обнаружить внутриклеточный CTLA-4 в Treg методом проточной цитометрии?

Да. CTLA-4 конститутивно экспрессируется во внутриклеточных компартментах Treg и лишь транзиторно появляется на клеточной поверхности после активации. Для внутриклеточного окрашивания сначала фиксируйте и пермеабилизируйте клетки, затем окрашивайте флуорохром-конъюгированным антителом к CTLA-4. Для поверхностного окрашивания активированных Т-клеток стимулируйте анти-CD3/CD28 в течение 24-48 часов перед окрашиванием.

Как настроить репортерный генный анализ блокирования CTLA-4/B7?

Типичный анализ предполагает ко-культивирование репортерных клеток Jurkat-NFAT-Luc, экспрессирующих CTLA-4, с антигенпрезентирующими клетками CHO, экспрессирующими CD80. Связывание CTLA-4 подавляет NFAT-управляемый люциферазный сигнал; добавление блокирующего антитела к CTLA-4 снимает супрессию, генерируя дозозависимое увеличение люминесценции. Используйте рекомбинантный белок CTLA-4 в качестве калибратора и биоаналог Ипилимумаба как положительный контроль.

Список литературы

1. Rowshanravan B, et al. (2018) CTLA-4: a moving target in immunotherapy. Blood. 131(1):58-67. PMID: 29118008

2. Hodi FS, et al. (2010) Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363(8):711-723. PMID: 20525992

3. Wei SC, et al. (2018) Distinct cellular mechanisms underlie anti-CTLA-4 and anti-PD-1 checkpoint blockade. Cell. 170(6):1120-1133. PMID: 28803728